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鈣離子熒光探針常見問題大盤點

發布者:艾美捷科技    發布時間:2021-06-02     
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鈣可作為多種細胞中的通用第二信使,Ca 2+調節所有類型細胞的許多功能,因此鈣測量對于各種生物學研究至關重要。在1980年代,Tsien及其同事生產了各種熒光指示劑。其中Indo-1,Fura-2,Fluo-3和Rhod-2是測量Ca 2+濃度的最有價值的染料。近年來,熒光探針領域引領者AAT陸續推出了更優秀的鈣離子探針:Fluo-8 ?,Cal-520 ? 和Calbryte?520,這些為實現高通量監測鈣濃度,篩選GPCR和鈣離子通道藥物篩選提供了有力的工具。

 

然而,面對市面上五花八門的鈣離子探針,我們該如何選擇呢,別慌,小艾之前撰寫的這兩篇文章可以帶給大家一些幫助:

鈣離子熒光探針大盤點—助您拍出好鈣片,點擊了解

鈣離子熒光探針專題2——比值型熒光探針,點擊了解

 

本期我們總結了幾個關于鈣離子探針的常見問題,都是平時大家經常咨詢的,相信大家或多或少也遇到過相關的問題,今天做了一個匯總希望能給大家帶來一些幫助:

 

1.檢測內質網(ER),線粒體內的鈣離子濃度變化,該使用哪款探針?

線粒體鈣離子檢測:Rhod-2(21060),Rhod-2,是羅丹明123(Rhodamine 123)的衍生產物,一種與鈣離子結合產生熒光,同時由于其正電荷特性,會特異性聚集在線粒體里,由此用于測定線粒體內鈣離子水平。在熒光酶標儀下,激發波長550nm,發射波長 590nm,可用來定量測定線粒體中的鈣濃度。

內質網鈣離子檢測: Cal-520N(Cat# 21146), Calbryte 520L(Cat# 20640), Fluo-5N(Cat# 20566)和Mag-fluo4(Cat# 20401);

 

關于內質網內鈣離子標記可參考下方文獻:https://www.researchgate.net/profile/Alexei-Verkhratsky/publication/226512100_

Ca2_Imaging_of_Intracellular_Organelles_Endoplasmic_Reticulum/links/0c96052961398ab829000000/Ca2-Imaging-of

-Intracellular-Organelles-Endoplasmic-Reticulum.pdf?_sg%5B0%5D=ndp33K01GY0Unl4pu9_TSJkuSDdL55Obb4-jEU06s-fq6J5aJm_dumpO6B8Xta2_AVR3qrQb36uvh1o1W33oLw.Hcd0tb6mWOMf1r1IRgUPhX4UXQ3yrDvIrS7me5OmCKZvqeETZ

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2.檢測細胞中鈣離子時加入丙磺舒(probenecid)的作用是什么?文獻報導丙磺舒(probenecid)可能干擾鈣離子通道,比如干擾環核苷酸門控通道,有沒有可以不用丙磺舒的鈣離子探針?

丙磺舒(probenecid),是一種陽離子轉運體抑制劑,用來降低探針進入胞內后被排除的幾率,以提高胞內信號。常見的Fluo-3 、fluo-4、 Fluo-8都需要加丙磺舒,否則信號會很低。您可以選擇Calbryte系列,該系列無需丙磺舒(probenecid)仍會有很好的信號。

 

存在丙磺舒.jpg

不存在丙磺舒.jpg

圖示:存在丙磺舒(左)和不存在(右)的情況下進行Ca2+檢測測定,并使用Ex / Em = 540/590的FlexStation3測量了截止波長為570 nm的響應。

 

加或者不加丙磺舒(probenecid)對Fluo-4和Calbryte 520熒光標記結果的影響.jpg

圖示:加或者不加丙磺舒(probenecid)對Fluo-4和Calbryte 520熒光標記結果的影響

 

3.熒光探針的AM、鹽形式、Dextran葡聚糖形式有什么區別?

AM酯形式:AM酯形式是一種可以透過細胞膜進入細胞的,不需要其他輔助工具;

鹽形式:鹽形式的Fluo-8不能自行穿過細胞膜,需要輔助進入細胞,如微量注射等;

Dextran葡聚糖形式:若檢測孵育時間久容易發生區室化,比如鉆進了內質網等亞器官內,Dextran最大的優勢就是降低了區室化作用,但是需要顯微注射或其他方式才能進入細胞內。

 

4.有定量檢測樣本中鈣離子的試劑盒嗎?

人體血液里鈣離子的濃度大約在19 -10.5 mg/dL范圍內,血液里鈣離子濃度過低或者過高可引起低鈣血癥和高鈣血癥。Amplite 熒光法鈣離子定量試劑盒(Cat#36360)可用于定量體液的鈣離子濃度,可使用96孔或者384孔板經酶標儀讀取數值, 不需進行樣本分離直接檢測,30min可完成,最低檢測到0.03mM的鈣離子。

 

5.有能用于植物細胞擬南芥原生質體的鈣離子探針嗎?

常用的 Fluo-4 AM, Fluo-8 AM 以及 Calbryte 520 AM, 都適用于植物細胞,Fluo-4最常用,若要獲得更好的信噪比,推薦其升級版本 Calbryte 520 AM。

 

參考文獻:

https://www.nature.com/articles/s41438-020-0315-3

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3975371/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2923527/

 

6.常見的幾款綠色的鈣離子探針各有哪些優缺點?

 

幾款常見綠色鈣離子熒光探針性能比較:

產品名稱Ex/Em(nm)(信號背景比)S/B相對亮度細胞內
保留
加載時間其他
Fluo-3506/526250相比最低1 h在相同條件下,Calbryte探針的亮度明顯更高
Fluo-4494/5164.51001 h
Fluo-8490/5144.5~2000.5-1 h
Cal-520492/5149.0~1501-2 h
Calbryte-520490/51410.0~3500.5-1 h

 

幾款綠色熒光探針的熒光亮度對比:


幾款綠色熒光探針的熒光亮度對比:.jpg

 

7.單波長探針與比值型探針的區別有哪些?

 

綠色
熒光探針
紅色
熒光探針
深紅色
熒光探針
比率熒光探針(確定絕對和相對Ca2+濃度)鈣離子
免洗產品
Fluo-3
Fluo-4
Fluo-8
Cal-520
Calbryte 520
Rhod-2
Rhod-4
Cal-590
Calbryte 590
Cal-630
Calbryte 630
Fura-2
Fura-8
Fura-10 (NEW)
Indo-1
Cal Red R525/650
Fluo-4(免洗): 36325
Fluo-8(免洗): 36315
Calbryte 520(免洗、免丙磺舒):36318
Fura-2(免洗):36320
Rhod-4(免洗): 36334
Calbryte 590(免洗、免丙磺舒): 36201

 

單波長與比率法的優缺點對比

單波長比值型
1.在靜息鈣水平下背景熒光最小
2.良好的信噪比
3.大大提高了細胞內保留
4.覆蓋光譜:紫外線(UV),紫色和可見光激發
5.不同的親和力(低、中、高)提供的敏感度滿足于各種應用
1.準確測量細胞內鈣濃度
2.將染料負載不均勻、染料泄漏、光漂白和細胞厚度變化(常見于混合群體)的影響降至最低
3.提供更可靠和可重復的結果
4.指示劑擁有雙激發/發射光線

 

常見鈣離子探針推薦:

顏色名稱貨號
綠色熒光Fluo-321010
Fluo-420550
Fluo-821080
Cal-52021130
Calbryte 520(不需要丙磺舒)20650
 紅色熒光Rhod-221060
Rhod-421120
Cal-59020510
Calbryte 590(不需要丙磺舒)20700
深紅色熒光Cal-63020530
Calbryte 630(不需要丙磺舒)20720

 

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