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數據庫搜索 (Databases search)

發布者:艾美捷科技    發布時間:2021-05-24     
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一般來說,利用質譜數據鑒定蛋白質主要有兩種方法:肽質量指紋圖譜(PMF)和肽序列標簽分析(sequence tag analysis)。這兩種方法較傳統的 N 端測序或內部 Edman 測序法敏感數百倍,其檢測低限為飛摩爾(fmol)水平(如銀染的 2D膠點或 1D 膠帶)。然而,足夠多的樣品蛋白量可以增加識別的成功率,這是因為增大樣品蛋白量可以克服一些污染物的干擾(如角蛋白,在樣品中的存在非常常見)。數據庫的檢索是利用計算機程序算法將實驗測得的肽質量數據與蛋白質序列數據庫中的蛋白質的肽質量計算值進行相關性比較分析,從而得出可能蛋白質的概率并將相關性最好的結果排序,這是凝膠分離蛋白質鑒定的最常用手段。


這種檢索途徑有一個明顯的限制,就是被鑒定的蛋白質必須在序列數據庫(蛋白質數據庫和核酸序列翻譯數據庫)中存在。PMF 檢索鑒定蛋白質是依據實驗中獲得的蛋白質的多個肽段質量數據與同一蛋白質肽段質量理論計算值的之間的相關性比較。因此,這一技術不適用于檢索 EST 翻譯序列,也不適用于鑒定蛋白質的混合物。而肽序列標簽分析(sequence tag analysis)可適用于檢索EST 數據庫。對PMF 數據,主要搜索Swiss Prot (速度快但不全面)和NCBI (速度雖慢但包含更多的信息)數據庫。如果你認為你的蛋白質可能為新的蛋白質,選擇NCBI數據庫,標準搜索選擇Swiss Prot 數據為好。如果需要,也可搜索EST數據庫(用MS/MS數據按搜索更有效)。


檢索條件的設置與結果判斷:


1.肽片段質量選擇在 800-4000Da 范圍。


2.氨基 酸 殘 基 的 修 飾 ( Modifications ):半 胱 氨 酸 為 脲 甲 基 半 胱 氨 酸(Cardamidomethyl-Cys),蛋氨酸選擇可變修飾—氧化。


3. 最大允許的肽質量誤差( Mass Tolerances),與儀器性能和數據質量有關,一般設為±0.1Da,最大為±0.5Da,質量誤差愈小,搜索的特異性愈高。


4. 不完全酶解位點數目(Missed cleavages):每個肽允許有 2 個不完全裂解位點,一般選 1(如果蛋白充分變性且酶解完全)。


5. 參考蛋白質表觀分子量和等電點,表觀 PI 誤差范圍為±0.5pH,表觀 Mr 誤差為范圍為±20%。一般情況下不選此項,在判讀結果時參考。


6. 物種選擇:限定物種。


7. 離子選擇:[M+H]+,單同位素


8. 最少匹配肽片段規定為 4。

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