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SDS-PAGE膠染色

發布者:艾美捷科技    發布時間:2021-05-21     
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一、各種蛋白染色方法的靈敏度比較


silver1.png


二、考馬斯亮藍染色


CBB 染色液


0.5%考馬斯亮藍 G250 或 R250


40%甲醇


10%乙酸


將 CBB 溶于甲醇中并不停的攪拌 15min。加入乙酸與 ddH2O


脫色液:30%甲醇


10%乙酸


染色方法:1.在搖床上染色 30min.


2.脫色至蛋白點或條帶清晰可見


3. ddH2O 洗 3-5 次


三、膠體考馬氏亮藍染色Colloidal Coomassie Staining(Cambridg ecentre for porteomics)


sensitivity = ~100ng


1.固定:甲醇/醋酸/H2O(45:1:54)至少 20min.


2. 染色 12-18hr。


染色液:


17% (w/v) 硫酸銨


34%甲醇


0.5%醋酸


0.1% (w/v) Coomassie G250


3. 脫色:用 H2O 脫色至蛋白點和背景清晰.


雙向電泳蛋白點的切取和保存


1.用 PDQuest 軟件或肉眼比對,找出感興趣的蛋白點,并做好標記和記錄。


2. 用 MilliQ 水沖洗膠 2 次。


3. 用色譜純甲醇和 MilliQ 水沖洗 Ep 管


4. 將槍頭(200ul)下端剪去,使其內徑略小于蛋白斑點的直徑,用色譜純甲醇和MilliQ 水沖洗槍頭。


5. 對準斑點中央小心將蛋白切割下來,放入 Ep 管,MilliQ 水漂洗 2 次,如膠塊太大,將其切成 1 x 1 mm 的膠片。


6.將切好的點做好標記和記錄,置-80oC 保存或凍干后-20oC 存放。


注意事項:


1.盡量避免皮膚和頭發的角蛋白的污染,在操作過程中應戴一次性的 PE 手套(不用乳膠手套)和帽子。


2. 不要將膠長期存放于乙酸溶液中。


3. Ep 管及染膠的容器必須用甲醇和水充分清洗,尤其應與進行 Western blotting的容器分開,以避免 casein 或 BSA 的污染。


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